Tecnologie per flussi di lavoro completamente automatizzati nella diagnostica molecolare infettivologica in Real Time PCR

Il primo risultato del progetto è stata l’individuazione del termociclatore Real Time Mic da integrare sul piano di lavoro dei robot programmabili per la manipolazione e il processamento dei fluidi che vengono utilizzati per la preparazione e l’allestimento delle reazioni che avvengono nel termociclatore.

In seguito sono stati individuati gli algoritmi o metodi per l’elaborazione automatica delle curve di amplificazione che si concludono con la determinazione del ciclo soglia C_T, ossia il ciclo termico in cui la fluorescenza supera un determinato valore di soglia (threshold), legato alla quantità di acido nucleico del virus che si vuole quantificare.

Il software di analisi integrato nello strumento effettua calcoli automatici di C_T, tuttavia in pratica non sono infrequenti le situazioni in cui fallisce. Ciò si verifica quando la forma della curva, che dovrebbe essere simile ad una funzione sigmoidea (curva ad S), presenta deviazioni più o meno marcate, per esempio in termini di oscillazioni nella parte iniziale che dovrebbe essere piatta, oppure di ritardo nella parte di salita, che può determinare anche l’assenza del plateau finale, oppure di valori anormalmente bassi del plateau finale. In pratica l’esperto valuta se il campione è da considerarsi idoneo oppure da respingere attraverso la forma della curva ottenuta. Inoltre, può dover adattare manualmente parametri di analisi come la baseline da sottrarre o la threshold. Gli algoritmi e i metodi sviluppati nel progetto sostituiscono queste operazioni manuali. In una delle fasi di sviluppo del progetto, inoltre, è stata brevettata la cosiddetta reazione “Pan Control” ossia un singolo controllo di reazione che comprende le reazioni che coinvolgono il controllo positivo (PC) e il controllo negativo (NTC) nei saggi qualitativi o quantitativi di PCR. In particolare, il “Pan Control” permette di accertare la totale assenza di contaminazione, requisito normalmente raggiunto dall’assenza di segnale nel NTC, e il corretto funzionamento dei reagenti di reazione, di norma monitorati attraverso l’aggiunta del controllo positivo (PC). L’inserimento del “Pan Control”, durante i saggi analitici di validazione, permette l’utilizzo di un unico tubo di reazione.

Infine è stato messo a punto il metodo delle curve virtuali su un ampio insieme di campioni, adeguato a dimostrarne la sicurezza ed efficacia, anche in occasione delle verifiche ispettive effettuate dagli enti notificati per la certificazione aziendale secondo la ISO 13485 – Sistema di Gestione Qualità per Dispositivi Medici.

Inizio: 07/01/2020
Fine: 13/03/2022